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Neuroquímica de la isquemia cerebral, excitotoxicidad, neuroprotección y futuro de los inhibidores de calpaína
Este texto es la adaptación electrónica de un trabajo que redacté en 1996 para un curso de doctorado sobre neuroquímica.
La isquemia cerebral es el resultado de la disminución, por debajo de un nivel crítico, del flujo sanguíneo cerebral global o del de un determinado territorio arterial cerebral, cuya consecuencia primaria es la falta de oxígeno y glucosa necesarios para el metabolismo cerebral.
Dado que la relación entre metabolismo cerebral y flujo sanguíneo, a través de la barrera hematoencefálica, es un proceso dinámico, altamente integrado, motiva que la interrupción del flujo sanguíneo al cerebro resulte en una alteración rápida del metabolismo y las funciones cerebrales.
La edad del paciente parece ser uno de los principales factores de riesgo de la isquemia cerebral. Considerando el envejecimiento como un proceso irreversible que se inicia en la madurez y se caracteriza por un desvío progresivo de un estado funcional ideal, no conocemos qué grado de desviación condiciona la probabilidad de riesgo. La pérdida de neuronas no es una consecuencia inevitable de la edad, dado que la plasticidad sináptica y dendrítica así como los mecanismos de adaptación pueden compensar perfectamente la pérdida de neuronas. El metabolismo energético se conserva con las mismas características que el adulto durante el envejecimiento fisiológico, no presentando variaciones significativas en el período comprendido entre los 30 y 80 años; las funciones intelectuales se conservan o incrementan. Se desconoce la existencia de un factor o factores que conduzcan a un envejecimiento del sistema nervioso. En general, las teorías de la vejez (teoría del error primario de Orgel, mensaje redundante de Medvedev y restricción codónica de Strehler) tienen escasa aplicación al sistema nervioso, por las características específicas de las neuronas y de la glía (1,2). Es posible que el factor edad en el caso de la isquemia cerebral esté más ligado a la acción de la edad en los sistemas cardiovascular y respiratorio que en el propio sistema nervioso central (3).
Al igual que cualquier otra célula viva las neuronas necesitan aporte energético para sobrevivir. Podríamos distinguir tres niveles de necesidades energéticas: un primer nivel mínimo que es absolutamente imprescindible para mantener la estructura celular y que si no puede obtenerse conduce hacia un daño neuronal irreversible y la neurona muere; un segundo nivel necesario para mantenerse en condiciones de realizar su función, es decir, la energía necesaria para mantener los gradientes de concentración iónica y un tercer nivel, que es la energía necesaria para realizar esa función.
El sistema nervioso por sus características especiales difiere notablemente del resto de los tejidos en lo referente a su metabolismo energético (2,4). El peso del cerebro es solamente el 2% del peso total del cuerpo pero recibe el 15% del flujo cardíaco y utiliza el 20% del oxígeno que consume el cuerpo. La energía le es suministrada en su totalidad por el metabolismo de la glucosa, excepto en circunstancias especiales, como cetosis y ayuno prolongado. La capacidad de depósito de glucosa y glucógeno del cerebro es reducida ya que esta reserva es capaz de cubrir los requerimientos energéticos cerebrales sólamente durante un minuto.
Estas diferencias con otros tejidos parecen debidas a que las neuronas no funcionan autónomamente, sino que están incorporadas a complejos neuronales, que para su funcionamiento se integran con otras partes del sistema nervioso. Además es preciso considerar el fenómeno de la selectividad de la barrera hematoencefálica, que limita la velocidad de transferencia de sustancias desde la sangre al cerebro. Esta barrera que se ha desarrollado para proteger al cerebro de sustancias nosógenas, condicionaría también los substratos potenciales para el metabolismo energético. Estas características del tejido nervioso, especialmente la utilización exclusiva de glucosa y el escaso margen de almacenamiento, obliga a un estrecho acoplamiento entre perfusión, metabolismo energético y función. Este acoplamiento y su alteración durante el insulto isquémico nos explicaría la fisiopatología de la isquemia.
El flujo normal en un adulto joven es de 57 mL/min/100 g de tejido (2). Por debajo de 20-25 mL/min/100 g el EEG se lentifica gradualmente. Con 18-20 mL/min/100 g las descargas espontáneas neuronales desaparecen. Con 15 mL/min/100 g las respuestas evocadas desaparecen. Por debajo de 8-6 mL/min/100 g se produce una masiva liberación de potasio, momento en el que la viabilidad neuronal desaparece (5). Por debajo de 20 mL/min/100 g aparecen los síntomas neurológicos.
Dado el acoplamiento entre perfusión y metabolismo y las escasas reservas energéticas cerebrales, al menos teóricamente la isquemia debería dar lugar a lesiones neuronales irreversibles a los pocos minutos de producirse el ictus. Esta opinión se mantuvo durante muchos años. Actualmente se ha podido demostrar que si las condiciones son óptimas, se pueden recuperar las funciones neurológicas tras un período de isquemia de 60 minutos de duración (6-9).
Se conocen algunos factores determinantes de esta recuperación después de prolongados períodos de isquemia, como pueden ser la edad (10), el sexo (11) y la tolerancia a isquemia de repetición (12). En términos generales los niños suelen resistir mejor la anoxia. Las hembras tienen una resistencia muy superior a la de los machos, quizás por el efecto antioxidante de los estrógenos.
Por otra parte se conoce que niveles moderados de hipoxia pueden dar lugar a alteraciones neurológicas permanentes, en casos como sujetos sometidos a by-pass coronario, o en escaladores de alta montaña (10) sin que se conozcan las razones por las que estos niveles de hipoxia provocan alteraciones funcionales, aunque se postula que pudiese ser debido a trastornos en la síntesis de neurotransmisores.
Histopatología de la isquemia cerebral
Las lesiones histopatológicas siguen a las alteraciones neuroquímicas y algunos de los cambios histológicos sólo pueden observarse después de la aparición de alteraciones neuronales irreversibles. Por otra parte se puso de manifiesto que determinadas neuronas son selectivamente vulnerables a la isquemia seguida de reperfusión. Las neuronas piramidales de las áreas CA1, CA3 y CA4 del hipocampo, las pequeñas y medianas neuronas del estriado, las células de Purkinje del cerebelo y las neuronas de la capa 3, 5 y 6 de la corteza, son las que presentan una mayor vulnerabilidad al insulto cerebrovascular (13). Estas neuronas presentan como fenómeno asociado la posibilidad de autolisis tardía, a pesar que después de la reperfusión presenten una morfología y función normales (3). Este proceso de autolisis tardía suele presentarse horas o días después de la normalización del flujo cerebral local. Esta vulnerabilidad podría depender de características intrínsecas de las neuronas. Sin embargo, en el caso del hipocampo se ha comprobado que el "clearance" de lactato después de la reperfusión es más lento que en otras zonas y este factor pudiera contribuir a explicar la vulnerabilidad de estas neuronas (14). Los cambios morfológicos se pueden observar a los pocos minutos tras el inicio de la isquemia. El grado de desorganización celular provocada por la isquemia está en función de la intensidad y duración del insulto. La alteración neuronal es más precoz que la presentada por astrocitos y células endoteliales. Al principio se presenta el denominado estado de microvacuolización, que se caracteriza por hinchazón de las mitocondrias asociado a fallo del gradiente iónico, desorganización de las crestas y formación de microvacuolas en el citoplasma. Estos cambios iniciales remiten totalmente si se produce una pronta reperfusión.
De no producirse la recuperación precoz del flujo sanguíneo cerebral, las neuronas se reducen de volumen, el núcleo se desplaza, la cromatina se altera, los microtúbulos se fragmentan y los ribosomas se dispersan. Este proceso se acompaña de edema de los astrocitos perineuronales y perivasculares, así como invaginación del neurosoma (15).
Estos cambios histológicos no son típicos de la isquemia; pueden encontrarse en la hipoxia o anoxia, cualquiera que sea su etiología, en el estatus epiléptico o en la hipoglucemia, especialmente en las fases tardías. En las fases iniciales parecen existir diferencias morfológicas entre la hipoglucemia y la isquemia. En la hipoglucemia las mitocondrias presentan una disminución de volumen, a diferencia de la isquemia en la que las mitocondrias se edematizan.
Parece lógico pensar que las neuronas afectadas mueren como consecuencia directa de la pérdida de energía. Sin embargo, las investigaciones realizadas en los últimos años han demostrado que entre la aparición de la isquemia y la muerte neuronal se desarrolla una cascada reacciones químicas en la neurona que, en último término, parecen ser las responsables de la muerte neuronal. El conocimiento lo más detallado posible de estas alteraciones del metabolismo neuronal parece de interés dado que permite la esperanza de poder obtener fármacos que bloqueando esta cadena de reacciones permitan una recuperación funcional de los síndromes isquémicos cerebrales muy superior a los que se consigue actualmente.
No hay aspecto del metabolismo neuronal que se vea libre del efecto de la isquemia, si bien los factores neuroquímicos determinantes del daño neuronal irreversible no se conocen en su totalidad. El fallo en la producción de energía, la acidosis láctica, la alteración del balance del calcio y la acumulación extracelular de neurotransmisores, con la consiguiente activación de receptores y estimulación neuronal en circunstancias de fallo de aporte de oxígeno y glucosa, parecen ser pasos importantes en los procesos que conducen a la muerte de la neurona (3,16,17).
Los escasos depósitos de oxígeno y glucosa de las neuronas son consumidos, durante la isquemia, en cortos períodos de tiempo. La falta de oxígeno altera la respiración mitocondrial y las neuronas metabolizan la glucosa residual a ácido láctico en vez de CO2 y agua. Se utiliza el ATP de reserva pero, al no producirse, se acumula AMP que no posee enlaces de alta energía. Hay un incremento del ácido láctico que llega a un nivel máximo aproximadamente en tres minutos desde el inicio de la isquemia, y de los nucleótidos de adenina que alcanzan su máxima producción a los 10 minutos posteriores al insulto isquémico (8). Dado que los niveles de los nucleótidos de adenina regulan diversas enzimas del metabolismo de proteínas, carbohidratos y lípidos, se produce una alteración global del metabolismo neuronal.
La falta de ATP altera el funcionamiento de la bomba sodio-potasio-ATPasa, lo que implica un incremento progresivo en la conductancia del potasio, seguida por una salida masiva de potasio (18). Cuando los niveles extracelulares de potasio alcanzan los 15 m mol/g, el potasio extracelular despolariza los canales de calcio dependientes de voltaje y como consecuencia el 95% del calcio extracelular penetra en el interior de la neurona. La falta de energía impide que el calcio sea retenido en el retículo endoplásmico y sea transportado a las mitocondrias. Como consecuencia el calcio libre intracelular provoca una cascada metabólica que activa enzimas proteolíticas y lipolíticas que pueden llevar a abolir de forma irreversible la regulación del metabolismo neuronal.
La acumulación de ácido láctico y el aumento de CO2 causa acidosis que permite alcanzar valores pH de 6, pudiendo llegar los niveles de ácido láctico a 40 m mol/g (19). Estos valores de pH pueden desnaturalizar las proteínas y alterar las funciones de las enzimas cuyas actividades son pH-dependientes, se inhibe la reoxidación de NADH, la recaptación de neurotransmisores y se promueve la formación de radicales libres.
El aumento de adenosina, producto de metabolismo de los nucleótidos de adenina, provoca una intensa vasodilatación e incremento del edema. La isquemia, por otra parte, favorece la transformación de adenosina en hipoxantina que se sigue de la formación de peróxidos, que contribuyen a la alteración de la membrana neuronal.
El incremento del calcio intracelular da lugar a un incremento de la liberación de neurotransmisores y neuromoduladores que consecuentemente dan lugar a una activación de los diferentes receptores y a una sobrecarga de estímulos de las neuronas que aumentan la entrada de calcio, la activación de proteasas y, en definitiva, a la destrucción celular.
Las aminas biógenas, tales como noradrenalina y serotonina, provocan edema; la serotonina es además vasoconstrictora y facilita los procesos de hemocoagulación. Se puede comprobar que ciertos fármacos como la p-clorofenilalanina que bloquea la síntesis de serotonina, la fenoxibenzamina que bloquea receptores alfa adrenérgicos y la reserpina, que provoca una deplección de la reserva de noradrenalina, atenúan las alteraciones provocadas por la isquemia. Sin embargo parece que el neurotransmisor que juega el papel más importante en muerte neuronal que sigue a los cuadros isquémicos es el glutamato (20). El resultado de la muerte neuronal inducida por la hiperestimulación provocada por el glutamato se ha denominado excitotoxicidad.
Neuroprotección y excitotoxicidad
Durante años se ha pensado que el ictus cerebral establecido es un proceso irreversible e intratable. Llama la atención que el órgano más noble del cuerpo siga siendo objeto del más absoluto nihilismo terapéutico por parte de la medicina. Así como se han conseguido grandes avances en la prevención primaria y secundaria del infarto cerebral, principalmente gracias a los fármacos antiagregantes y anticoagulantes, el tratamiento del ictus agudo sigue siendo teoría. Los estudios sobre fibrinolisis no acaban de decantar la balanza entre el beneficio y el riesgo. Así las cosas, la fibrinolisis, tan efectiva en la isquemia coronaria y arterial periférica, no deja de ser un tratamiento experimental en la enfermedad cerebrovascular isquémica. En la actualidad se piensa que la fibrinolisis será el tratamiento de elección del infarto cerebral pero, para ello, todo parece indicar que serán precisas terapias combinadas para potenciar su acción y evitar principalmente los efectos de la reperfusión. Se están ensayando fármacos de muy diversas categorías cuya principal acción es el bloqueo de los transtornos metabólicos de la cascada isquémica con el objeto de evitar o al menos paliar la muerte celular y para ello se ha acuñado el término de neuroprotección (Tabla 1).
Desgraciadamente ninguno de estos fármacos parece cumplir lo suficiente con el fin del término que los engloba, neuroprotección, lo que puede ser debido a la inespecificidad de las acciones que se les han propuesto, unas veces en base a hipótesis simplistas y otras demasiado pretenciosas. De cualquier modo no cabe duda que la búsqueda de un fármaco tal, que sea capaz de bloquear suficientemente la cascada catabólica celular, es una tarea difícil puesto que nuestros conocimientos de los procesos que subyacen en la neurona tras la isquemia no dejan de ser insuficientes, parciales y en la inmensa mayoría, si no en todos los casos, se basan en hallazgos epifenomenológicos. Por tanto, las hipótesis actuales de actuación farmacológica basadas en tales supuestos se encuentran en disarmonía con el fin último que pretenden, que no es otro que evitar la muerte neuronal.
De la creciente lista de neuroprotectores se ha prestado una especial atención a aquellos fármacos capaces de bloquear los receptores NMDA para el glutamato. Curiosamente, la mayoría de las neuronas más susceptibles a la isquemia, están inervadas por fibras glutamatérgicas. Esta evidencia sugirió que debía haber una relación entre la neurotransmisión mediada por glutamato y el daño neuronal postisquémico. La isquemia prolongada tiene como resultado una elevación del calcio intracelular y un aumento de la actividad del calcio en la terminal presináptica, que lleva a la liberación de varios neurotransmisores, dependiendo del tipo de neurona (21). Por ejemplo, la liberación de neurotransmisores excitatorios como glutamato o aspartato se multiplica ocho veces durante diez minutos de isquemia, en comparación con la concentración preisquémica (22).
La concentración creciente de aminoácidos excitatorios en los espacios sinápticos causa una acción excitotóxica (23,24) en las neuronas postsinápticas vulnerables. Además de los aminoácidos excitatorios, si un agonista estimula el correspondiente receptor metabotrópico, como el colinérgico muscarínico, alfa-1, H1 histaminérgico, 5-HT1c, 5-HT2 y el receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), la fosfolipasa C (FLC) se activa mediante una proteína G.
La hiperactivación de receptores ionotrópicos de aminoácidos excitatorios (NMDA, AMPA, kainato) en la membrana postsináptica, resulta en un flujo mantenido de sodio y calcio a través de tales canales modulados por ligando. El flujo de sodio causa despolarización que abre los canales de calcio dependientes de voltaje, lo que resulta en una mayor entrada de calcio. El calcio neuronal alcanza altas concentraciones nanomolares y en consecuencia activa una serie de sistemas calciodependientes, como los mediados por calmodulina, proteínquinasa C, fosfolipasa A2 y calpaína. La activación sin control de uno o quizás de todos estos procesos se piensa que es la responsable de la muerte neuronal retardada.
En busca de un neuroprotector eficaz
En la pasada década, la excitotoxicidad (resultante de una liberación excesiva presináptica y un impedimento de la recaptación de glutamato) ha sido demostrada como mediadora de daño neuronal en isquemia cerebral. En modelos in vivo de isquemia cerebral global o focal, los antagonistas tanto de los receptores NMDA (v.g. dizocilpina) como los del receptor AMPA (v.g. 2,3-hidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo[F]-quinoxalina [NBQX]) han demostrado una significativa neuroprotección (25,26). Sin embargo, el bloqueo de receptores ionotrópicos de aminoácidos excitatorios no parece que sea el método ideal para impedir la acción excitotóxica, ya que estos fármacos tienen efectos secundarios psicotomiméticos, al parecer en relación con el antagonismo del receptor NMDA (27). De este hecho, que pudiese ser debido a la acción de tales fármacos sobre el sitio de unión de la fenciclidina del receptor NMDA o a la neuromodulación de otros sistemas neurotransmisores, se deduce que el bloqueo de fenómenos celulares "postreceptor" que fisiológicamente están silentes sea una interesante opción investigacional, y en un futuro terapéutica. El bloqueo agonista NMDA influye no solo en el proceso patológico sino también en el fisiológico. Podríamos decir que, en investigación básica, la "moda glutamatérgica" está dando paso a la búsqueda de bloqueantes selectivos de la cascada catabólica inducida por los excitotóxicos. Se presume que estos potenciales fármacos de acción intracelular, al actuar sobre vías que se activan durante la isquemia, permitan una más eficaz y selectiva acción sobre el proceso de muerte neuronal inducida por las noxas hipoxicoisquémicas (y probablemente por otras causas "neurodegenerativas"), sin acciones colaterales sobre el tejido sano (28,29).
Una de las muchas proteínas celulares activadas por calcio en las células de los mamíferos es la proteasa neutra conocida como calpaína. Hay dos isoformas principales: microcalpaína (m -calpaína), o calpaína-I, y milicalpaína (m-calpaína), o calpaína-II, las cuales requieren bajas o altas concentraciones micromolares de calcio, respectivamente, para ser activadas. Tiene dos subunidades, de aproximadamente 80 kDa y 29 kDa. El calcio induce su autolisis y la actividad catalítica del producto (76 kDa y 18 kDa) también es calcio-dependiente. La calpaína parece tener selectividad por algunas proteínas celulares (30,31). Éstas incluyen proteínas del citoesqueleto (v.g. espectrina), receptores de membrana (v.g. el receptor del factor de crecimiento epidérmico), proteínas dependientes de calmodulina, proteínas G, enzimas implicadas en señales de transducción (como la proteínquinasa C) y muchos otros factores de transcripción.
Hay crecientes pruebas de que la excesiva activación de la proteasa calcio-dependiente calpaína pudiese jugar un papel importante en la fisiopatología de una gran variedad de enfermedades, como la isquemia cerebral o miocárdica, distrofia muscular, agregación plaquetaria y formación de cataratas. Actualmente es difícil confirmar el papel exacto de la calpaína en tales enfermedades debido a la ausencia de un inhibidor potente, selectivo y permeable a la membrana celular. Sin embargo, dadas las múltiples y potenciales aplicaciones terapéuticas, es obvio que conseguir un selectivo y eficaz inhibidor de la calpaína es una importante meta farmacológica.
Inhibidores de Calpaína
Hay un gran número de agentes inhibidores de calpaína descritos en la literatura. El más potente de todos es el inhibidor natural endógeno de calpaína conocido como calpastatina. La mayoría de ellos tienen un sitio diana en la molécula de calpaína pero, en contrapartida, son pocos selectivos (actúan sobre otras proteínas) y muestran poca permeabilidad celular, lo que los hace malos candidatos como futuros neuroprotectores. Los inhibidores de calpaína actualmente usados en investigación se detallan en la tabla 2.
Las enfermedades en las que la sobreactivación de calpaína parece estar implicada son variadas. La inhibición de calpaína es una potencial herramienta terapéutica en numerosas enfermedades (Tabla 3).
Perspectivas
En resumen, es evidente que la sobreactivación de calpaína puede tener un papel clave en un gran número de enfermedades, siendo el nexo común de todas ellas la sobrecarga cálcica celular. El papel fisiológico de la calpaína no están todavía bien definido, pero se piensa que está implicada en procesos celulares específicos unidireccionales (como la mitosis y los mecanismos de fusión de membranas). Dado que se requiere un aumento mantenido de las concentraciones intracelulares de calcio para su activación, la calpaína está latente en las células en reposo, mostrando su actividad proteásica principalmente en los procesos patológicos, como la isquemia cerebral. Por ello parece que la intervención farmacológica sobre este tipo de proteínas es una meta a conseguir y puede ser el futuro del tratamiento neuroprotector. Es previsible que la inhibición de calpaína tenga menos efectos secundarios en terapéutica humana que la inhibición de eventos metabólicos previos a su activación en los procesos patológicos, como es el caso del antagonismo del receptor NMDA de glutamato y aspartato, habida cuenta que calpaína raramente se activa bajo condiciones fisiológicas y que la acción de los aminoácidos excitatorios es imprescindible para el normal funcionamiento del sistema nervioso.
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Mayo de 1996, David Ezpeleta
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